Röntgendiffraktometrie (XRD, X- ray diffraction)

 

 

 

 

 

Einleitung

 

 

 

Seitdem die Analyse, im Besonderen die Strukturaufklärung, von Proteinen zu einer der Hauptaufgaben der physikalischen Chemie wurde, ist auch das Anwendungsgebiet der Röntgendiffraktometrie auf diesen Bereich ausgeweitet worden.

 

Im Gegensatz zur Strukturaufklärung von Proteinen mittels NMR (nuclear magnetic resonance, Kernspinresonanz) ist die Methode der Röntgenstrukturanalyse auch für große Proteine anwendbar. Die Grenze der Strukturaufklärung von Proteinen mittels NMR liegt bei etwa 500kDa[1]. Im Moment realistisch ist aber eher nur eine vollständige Aufklärung bis zu etwa 50kDa[2]. Das Problem liegt hier in der Fülle der shifts (chemische Verschiebungen) die bei einem Protein in der Größe von bis zu 500kDa nur mehr schwer zuzuordnen sind.

 

Voraussetzung für eine Röntgenstrukturanalyse ist jedoch das Vorhandensein eines Kristalls, viele Proteine kristallisieren jedoch nicht. Liegt von einer chemischen Verbindung (Molekül etc.) ein geeigneter Kristall, das heißt am besten ein Einkristall, vor ist es je nach Komplexität der Verbindung nur mehr eine Sache von Minuten bis Wochen bis die Struktur aufgeklärt ist.

 

Um sich neue Möglichkeiten in der Röntgenstrukturanalyse von nicht – kristallisierenden Proteinen zu verschaffen wird heute eine besondere Technik verwendet. Man stellt durch geringe Veränderungen am Protein einen Mutanten her, in der Hoffnung dass dieser kristallisiert. Zum Teil gehen aber diese „geringen“ Veränderungen hin bis zu einem Entfernen von großen Seitenketten.

 

 

Der Nachteil der Röntgendiffraktometrie auf dem Gebiet der Proteinanalytik (Stichwort „Proteomics“) liegt aber in der Tatsache dass hier ein Proteinkristall vermessen wird, die Proteine aber in ihrer biologisch wirksamen Form stark verdünnt in Lösung vorliegen.

Der Unterschied zwischen dem Kristall und dem gelösten Protein kann, bezogen auf die Struktur, ein sehr großer sein. Proteine haben in Lösung mehr Freiheitsgrade als im streng geordneten Kristallgitter und können dadurch verschiedene Positionen einnehmen. Es kommt so z.B. zu Bewegungen von Seitenketten, des backbones („Rückgrat“ des Proteins, Haupt- Peptidkette). Die Wechselwirkungen die die dreidimensionale Struktur des Proteins verursachen (hier sind v.a. a- Helices und b- Faltblätter von besonderer Wichtigkeit) können zusätzlich eine Strukturveränderung des gelösten Proteins bewirken.

 

Genau diese räumlichen Strukturen sind aber für die Aufklärung von Wirkungsmechanismen verschiedener Proteine von besonderer Wichtigkeit. Es geht in diesem Kontext den Forschern meist darum die Wirkungsmechanismen aufzuklären, dazu muss das aktive Zentrum des Proteins erkannt und die Enzym – Substrat – Reaktion aufgeklärt werden. Diese spielt sich aber, wie schon erwähnt, in Lösung ab.

 

Zu diesem Zweck werden heute unter anderem Proteinkristalle mit dem Substrat oder einem andern Wirkstoff, wie z.B. einem Enzymhemmer (Gegenmittel, Blocker...), versetzt. Es kommt dabei im günstigsten Falle zu einer Enzym - Reaktion am Proteinkristall wodurch die Enzym – Substrat – Reaktion aufgeklärt werden kann.

Im Allgemeinen kann aber mit verschiedenen Rechenmodellen abgeholfen werden die das Verhalten des kristallisierten Proteins in Lösung simulieren können.

 

An der Karl – Franzens – Universität Graz beschäftigt sich eine große Forschungs-gruppe unter der Leitung von Prof. Dr. Christoph Kratky mit der Strukturaufklärung von Proteinen mittels Röntgendiffraktometrie (Strukturbiologie). Auf diesem Bereich läuft dort zur Zeit eine Fülle an Forschungsprojekten, ebenso konnte eine Vielzahl von Publikationen in renommierten internationalen Fachzeitschriften veröffentlicht werden.

Strukturbiologie UNI - Graz

 

 

Neben der Proteinanalytik kann die Röntgendiffraktometrie natürlich zur Strukturaufklärung sämtlicher kristallisierender Substanzen verwendet werden.

So beschäftigt sich z.B. an der Karl – Franzens – Universität Graz Prof. Dr. Ferdinand Belaj mit der Synthese und Strukturaufklärung von Phosphazenen.

Prof. Belaj UNI - Graz

 

 

 

 

 

 

Inhaltsverzeichnis



[1] kDa... Kilodalton (1 Dalton entspricht der Atommasse 1g/mol)

[2] Dr. Herbert Kogler, Fa. Aventis, Frankfurt: Vortrag am Institut für Chemie, Dezember 2002